Картирование разнообразия африканских трипаносом с использованием пространственной протеомики высокого разрешения.

Nature Communications, том 14, номер статьи: 4401 (2023) Цитировать эту статью

2065 Доступов

26 Альтметрика

Подробности о метриках

Африканские трипаносомы — это диксенные эукариотические паразиты, которые создают значительное бремя болезней человека и животных в странах Африки к югу от Сахары. Разнообразие между видами и стадиями жизненного цикла сочетается с различными тропизмами хозяина и ткани внутри этой группы. Здесь пространственные протеомы двух африканских видов трипаносом, Trypanosoma brucei и Trypanosoma congolense, картированы на двух жизненных стадиях. Четыре полученных набора данных свидетельствуют об экспрессии примерно 5500 белков на тип клеток. Более 2500 белков каждого типа клеток классифицируются по конкретным субклеточным компартментам, образуя четыре полных пространственных протеома. Сравнительный анализ выявляет ключевые пути паразитической адаптации к различным биологическим нишам и дает представление о молекулярной основе разнообразия внутри и между этими видами патогенов.

Кинетопластиды представляют собой одноклеточные жгутиковые эукариоты, которые включают важных паразитов человека, домашнего скота и видов сельскохозяйственных растений и обычно передаются беспозвоночными. К этому классу относятся африканские трипаносомы, которые в совокупности заражают ряд млекопитающих и вызывают африканский трипаносомоз человека и животных. Большинство исследований, характеризующих африканские трипаносомы, было проведено с Trypanosoma brucei; отчасти потому, что два подвида заразны для человека, а также из-за относительной простоты культивирования in vitro и генетических манипуляций с этим видом. T. brucei изучался как паразит, но также и как дивергентный модельный организм, обладающий как хорошо сохранившимися, так и неканоническими эукариотическими биологическими особенностями, представляющими интерес. Родственные виды Trypanosoma congolense и Trypanosoma vivax являются основными возбудителями трипаносомоза крупного рогатого скота. Несмотря на их ветеринарное значение, этих видов было проведено значительно меньше исследований1. Различные виды африканских трипаносом имеют различные клеточные и инфекционные характеристики, однако молекулярная основа большей части этого неизвестна2,3,4,5.

Африканские трипаносомы подвергаются воздействию различных внешних сред в течение своего жизненного цикла, и паразиты различают ряд жизненных стадий, каждая из которых адаптирована к росту и выживанию в текущей среде или предварительно адаптирована к следующей6. Каждая стадия жизни основана на общей, высокоорганизованной клеточной архитектуре полярного ядра с одним жгутиком и набором одно- и многокопийных органелл. Относительные размеры, положение и содержание белка в органеллах различаются на разных стадиях жизни. Как и во всех эукариотических клетках, субклеточная локализация белка в трипаносомах определяет не только биохимическое окружение этого белка, но и потенциал молекулярных взаимодействий. Следовательно, функция белка тесно связана с его локализацией.

Существует два основных подхода к определению локализации белка в клетке: микроскопия и протеомика. Микроскопия позволяет точно определить конкретные локализации; может обнаруживать различия между клетками в образце; и может легко идентифицировать белки, локализованные в нескольких сайтах, хотя может страдать от артефактов мечения или неподходящей экспрессии. Из-за необходимости получить белок-специфическое антитело или генетически манипулировать интересующим белком, микроскопия обычно ограничивается небольшим количеством белков на исследование. Полнопротеомный микроскопический анализ представляет собой ценный, богатый набор данных, но нетривиальный и трудоемкий процесс, который пока ограничен несколькими видами: Saccharomyces cerevisiae7, Humans8 и T. brucei9.

Пространственная протеомика, основанная на выделении или обогащении органелл с последующей масс-спектрометрией (МС), позволяет идентифицировать белки, обогащенные в определенных субклеточных местах - обычно без необходимости генетической модификации. Эти методы оказались очень эффективными при выявлении белков-резидентов органелл или структур внутри трипаносоматид, таких как митохондрии, гликосомы, жгутики и ядра10,11,12,13,14. Высокопроизводительные методы на основе МС теперь можно использовать для систематической локализации тысяч белков в одном эксперименте для множества условий, состояний или типов клеток15,16,17,18,19,20,21,22. К таким методам относится HyperLOPIT (гиперплексная локализация белков органелл с помощью изотопной метки)16,23. Это подход количественной протеомики, при котором пространственная карта протеома может быть решена без необходимости изоляции отдельных органелл, что достигается применением алгоритмов машинного обучения24,25,26,27. HyperLOPIT и связанные с ним методологии LOPIT использовались для создания пространственных карт типов клеток млекопитающих, насекомых, дрожжей, растений и простейших16,21,28,29,30,31,32.

0.85 for all pairwise comparisons), demonstrating the reproducibility between experimental iterations (Supplementary Fig. 7 and Supplementary Data 8)47. Next, to define the spatial proteomes for each cell-type, final classifications were generated by performing TAGM-MAP analysis on each combined 33-plex dataset (Fig. 1A and Supplementary Data 9). Using this approach, 2679 and 2795 proteins were classified in T. brucei BSF and PCF respectively (Fig. 3A, B and Supplementary Data 9). In T. congolense, 2507 and 2504 proteins were classified in the BSF and PCF respectively (Fig. 3A, B and Supplementary Data 9). These four spatial proteomes provide a comprehensive localisation dataset for two closely related species, across two life-stages each, which has not been achieved on this scale before in any parasitic organism./p>

1e3; Average Reporter S/N > = 5; Isolation Interference <= 50%32. PSMs matching to contaminants (cRAP and cRFP) and those with missing values in any of the 11-plex TMT quantitation channels were removed. PSM intensities were sum-normalised then median-aggregated to the protein level. Each 11-plex TMT experiment was then concatenated to form a 33-plex dataset and proteins with missing values in any of the experiments were removed35./p>0.999 and separately an outlier probability <5 E-5. Proteins that did not meet the thresholding criteria were designated as ‘unknown’. To assess the reproducibility of classifications produced by individual experimental iterations, TAGM-MAP was also performed with the default settings on each 11-plex dataset separately. Classifications were retained if they exceeded a localisation probability >0.99. To assess the variability in classification between the experiments, datasets were compared pairwise using the adjusted Rand index which assigns a score of 0 if consistency is what is expected at random and 1 for perfect consistency using the R package mmclust (v1.0.1)47. To avoid inflating or deflating the ARI due to an excess of “unknown” allocations these were filtered before comparison. Analysis using TAGM-MCMC was then used to provide insight into proteins that were unknown according to TAGM-MAP where it could be due to dynamic protein localisation. This model was implemented using Markov-chain Monte-Carlo. The collapsed Gibbs sampler was run in parallel for 9 chains (T. brucei) and 4 chains (T. congolense) with each chain run for 10,000 iterations. Convergence was assessed using the Gelman-Rubin’s diagnostic and all Markov chains were retained for T. congolense; whilst for T. brucei the best two chains were retained. No thresholding criteria was applied with protein allocations and compartment joint probabilities are reported. Joint probabilities were used to evaluate proteins that may exhibit localisation to more than one compartment./p>=2X the number of genes versus the counterpart in T. brucei or T. congolense accordingly. Cases of two-one gene count orthogroups in T. brucei-T. congolense where two fasta header identifiers matched to a single gene identifier were removed from this set in T. brucei./p>