Выбор праймера гена 16S рРНК влияет - Компания Чжэцзян Горячие Продукты, ООО

Том 13 научных отчетов, номер статьи: 12577 (2023) Цитировать эту статью

118 доступов

Подробности о метриках

Секвенирование ампликона 16S рРНК или, в последнее время, метатранскриптомный анализ в настоящее время являются единственными предпочтительными методами микробного профилирования образцов, содержащих преобладающее соотношение человеческой и бактериальной ДНК. Однако из-за нецелевой амплификации ДНК человека текущие протоколы непригодны для биоптических образцов. Здесь мы представляем эффективный, надежный и доступный метод бактериомного анализа клинических образцов, в которых преобладает содержание ДНК человека. Мы определили профиль микробиоты в общей сложности в 40 биоптатах пищевода, желудка и двенадцатиперстной кишки человека, используя секвенирование ампликона 16S рРНК с широко используемыми праймерами 515F-806R (V4), нацеленными на область V4, праймерами 68F-338R и модифицированным набором Праймеры 68F-338R (V1-V2M), нацеленные на область V1-V2. С помощью праймеров V4 в среднем 70% вариантов последовательностей ампликонов (ASV) картируются в геноме человека. С другой стороны, эта нецелевая амплификация отсутствовала при использовании праймеров V1-V2M. Более того, праймеры V1–V2M обеспечили значительно более высокое таксономическое богатство и воспроизводимость анализа по сравнению с праймерами V4. Мы пришли к выводу, что метод секвенирования 16S рРНК V1-V2M является надежным, экономически эффективным и применимым для образцов человека с низким содержанием бактерий в медицинских исследованиях.

За последнее десятилетие исследование бактериома человека с использованием методов высокопроизводительного секвенирования, не зависящих от культуры, стало одним из наиболее часто используемых методов изучения бактериальных сообществ, населяющих самые разные ниши в организме человека1,2. Доступ к технологиям третьего поколения в сочетании со снижением затрат, связанных с высокопроизводительным секвенированием, привел к переходу от секвенирования гена 16S рРНК ампликона к секвенированию полного гена 16S рРНК и метагеномному/метатранскриптомному секвенированию в таких образцах, как кал, человеческое влагалище3 или мазки из кожа или полость рта4, которые содержат преобладающее соотношение человеческой и бактериальной ДНК. Однако в образцах с низкими концентрациями бактериальной ДНК или в образцах, «загрязненных» ДНК хозяина, таких как кровь, моча или образцы биопсии человека, профилирование бактериома по-прежнему во многом зависит от секвенирования гена 16S рРНК. Поскольку объем генерируемых данных относительно невелик, он не требует сложного биоинформатического анализа5, а цена более доступна. С другой стороны, результаты секвенирования ампликона 16S рРНК критически зависят от выбора гипервариабельных субрегионов из девяти доступных вариабельных областей, разбросанных по высококонсервативной последовательности гена 16S рРНК, а также от качества получаемой информации, а также от таксономических особенностей. точность может значительно варьироваться в зависимости от используемого набора(ов) праймеров6. В настоящее время подавляющее большинство исследований нацелено либо на одну вариабельную область V4, как в широко распространенном стандартизированном протоколе Earth Microbiome Project (EMP)7, либо на вариабельные области V1–V38 или V3–V59, как в протоколе двойного индексирования человеческого микробиома. Проект (HMP). Это происходит главным образом потому, что широко используемая платформа секвенирования Illumina производит только короткие последовательности (NextSeq, MiniSeq, iSeq ≤ 300 оснований и MiSeq ≤ 600 оснований). К сожалению, недавние исследования неоднократно показывали, что обычно нацеленная субобласть V4 гена 16S рРНК оценивает таксоны, обычно присутствующие в организме человека, наименее точно6,10,11. Более того, вместе с областью V3–V5 он особенно чувствителен к нецелевой амплификации человеческой ДНК12, особенно в образцах биопсии, что приводит к потенциальной потере редких таксонов и разрешению бактерий, поэтому значительная часть данных теряется.

Здесь мы демонстрируем новый протокол с использованием набора праймеров, нацеленных на субобласть гена 16S рРНК V1-V2, который резко снижает нецелевую амплификацию ДНК человека в образцах биопсии пищевода, желудка и двенадцатиперстной кишки, одновременно значительно увеличивая альфа-разнообразие и таксономические характеристики. точность по сравнению с обычно используемыми праймерами, нацеленными на область V4. Праймеры для амплификации для области V1–V2, включая функциональные возможности, необходимые для секвенирования (адаптеры и индексы проточных кювет), были оптимизированы для платформы Illumina MiniSeq с максимальной длиной считывания 150 п.о., что является экономически эффективным вариантом для любой лаборатории, заинтересованной в проведении высокопроизводительное секвенирование гена 16S рРНК. Для дальнейшего повышения эффективности таксономических классификаций мы включили конкатенацию парных чтений в биоинформационный конвейер13.

0.5%) between the datasets from the esophagus and duodenum biopsies showed increased representation of the abundant genera Prevotella, Fusobacterium, and Streptococcus in the V4 dataset and Neisseria, Haemophilus and Rothia in the V1–V2M dataset (Fig. 6). In biopsies from the stomach, we observed increased representation of abundant genera Prevotella and Fusobacterium only in the V4 dataset (Fig. 6). Indeed, the genus Tmx7 was nearly absent from all V4 datasets, and the genus Leptotrichia was nearly absent from V1–V2M datasets (Fig. 6)./p> 1% abundance and compared with our data (Fig. 7). Both data sets, V1–V2M and V4, showed a very high degree of correlation with the bacterial communities in the two standards (Fig. 7B,D). In the case of GM standard, the V4 primers slightly underestimated the genera Veilonella and Limosilactobacillus and the V1–V2M primers slightly underestimated the genus Bacteroides. An analysis of the FRT community showed a slightly higher representation of the genera Bacteroides, Agathobacter and Subdoligranulum in the V4 primer data set and of Anaerostipes in the V1–V2M data set. In general, however, these results show that the V1–V2M primers give comparable data to the V4 primers./p>