Специфическое обнаружение активности посева тау при болезни Альцгеймера с использованием рационально спроектированных биосенсорных клеток.

Молекулярная нейродегенерация, том 18, Номер статьи: 53 (2023) Цитировать эту статью

1094 доступа

14 Альтметрика

Подробности о метриках

Прионоподобное распространение тау при нейродегенеративных заболеваниях означает, что неправильно свернутый патологический тау может рекрутировать нормальный белок и шаблонизировать его агрегацию. Здесь мы сообщаем о методах разработки чувствительных биосенсорных клеточных линий для обнаружения активности посева тау.

Мы выполнили рациональный дизайн новых тау-зондов на основе современных знаний о структуре патологических агрегатов тау при болезни Альцгеймера. Мы создали стабильные клеточные линии биосенсоров на основе резонансного переноса энергии Фёрстера (FRET) и охарактеризовали их чувствительность, специфичность и общую способность обнаруживать биоактивный тау в образцах человека. По сравнению с эталонной линейкой биосенсоров оптимизированная конструкция зонда привела к повышению эффективности обнаружения посева тау. Повышенная чувствительность позволила обнаружить меньшее количество семян тау в образцах человеческого мозга, сохранив при этом специфичность семян тау, обнаруженных при болезни Альцгеймера.

Это следующее поколение биосенсорных клеток на основе FRET является новым инструментом для изучения активности посева тау в образцах человека с болезнью Альцгеймера, особенно в образцах с низким уровнем активности посева, что может помочь в изучении ранних патологических событий, связанных с тау.

Накопление в мозге тау-белка, ассоциированного с микротрубочками (MAPT), в нерастворимые агрегаты является основным нейропатологическим признаком болезни Альцгеймера (БА) и других нейродегенеративных заболеваний, называемых тауопатиями. Тау представляет собой внутренне неупорядоченный белок, обычно присутствующий в аксональном компартменте нейронов, где он играет роль в стабилизации микротрубочек. При БА гиперфосфорилированные формы тау накапливаются в цитоплазме и агрегируются в парные спиральные филаменты (ПГФ), представляющие собой бета-складчатые листовые нитевидные структуры [1, 2]. Стереотипная стадия по Брааку тау-патологии АД от энторинальной коры в гиппокамп, а затем и в лимбические области [3] коррелирует с гибелью нейронов и течением клинических симптомов [4,5,6,7,8]. Распространение агрегатов тау по взаимосвязанным анатомическим областям подтверждается убедительными доказательствами. Например, у трансгенных животных, сверхэкспрессирующих мутантный тау P301L в слое II энторинальной коры, в зубчатой ​​извилине образуются агрегаты тау человека, образуя в процессе эндогенный тау мыши [9]. Способность неправильно свернутых агрегатов тау рекрутировать нормальный тау по «прионному» механизму называется засевом и была воспроизведена в многочисленных экспериментальных моделях [10,11,12,13]. Роль посева в распространении патологии человека подтверждается обнаружением компетентного к посеву тау (также называемого биоактивным тау) в областях мозга, содержащих явную патологию нейрофибриллярных клубков, а также в последующих областях, свободных от явных патологических изменений. далее по пути Браака [14]. Склонность к высеиванию тау в посмертном мозге коррелирует со скоростью клинического прогрессирования, подтверждая фундаментальную роль этого явления при болезни Альцгеймера [15, 16].

Изучение механизмов посева при патологии БА значительно ускорилось благодаря разработке тау-биосенсорной клеточной линии, основанной на резонансном переносе энергии Фёрстера (FRET) [12]. Эта стабильная линия клеток эмбриональной почки человека (HEK 293 T) экспрессирует зонды, которые представляют собой проагрегирующий мутант P301S тау-повторного домена 4R (RD, аминокислоты 244–372), слитый либо с голубым флуоресцентным белком (CFP), либо с желтым флуоресцентным белком. (ЯФП). Добавление компетентного к посеву тау-материала, полученного из мозга AD, или предварительно сформированных тау-фибрилл индуцирует агрегацию этих флуоресцентных зондов и последующий сигнал FRET. Сигнал FRET можно определить количественно с помощью проточной цитометрии через 24 часа после инкубации с семенами тау. Чтобы повысить чувствительность обнаружения семян, липосомы смешивают с пригодным для посева материалом для преобразования семян в клетки [17]. В отсутствие липосом клетки биосенсора можно использовать для изучения механизмов поглощения семян [18, 19]. Биосенсорные клетки тау использовались для специфической амплификации и количественного определения небольших количеств биоактивного тау из различных образцов AD, включая экстракты головного мозга с использованием различных методов очистки, посмертную спинномозговую жидкость (СМЖ), прижизненную поясничную спинномозговую жидкость или внеклеточные пузырьки, полученные из мозга [20,21,22] ,23,24].