Ультра

Том 13 научных отчетов, номер статьи: 13017 (2023) Цитировать эту статью

157 доступов

Подробности о метриках

Идентификация видов необходима для предотвращения интродукции экзотических вредителей растений через глобальную торговлю. Многие из этих вредителей недостаточно изучены, и им не хватает общедоступных данных о последовательностях ДНК, на которых можно было бы основывать методы быстрой молекулярной идентификации. Одной из таких линий является род Chrysodeixis, который включает три вида, потенциально представляющие интерес для торговых инициатив США: C. includens, C. chalcites и C. eriosoma. Здесь мы описываем метод создания надежных профилей 45S рДНК с использованием секвенирования длинного чтения, чтобы прояснить эволюционные отношения и разработать метод идентификации ПЦР в реальном времени. Такой инструмент идентификации будет полезен для быстрой дифференциации карантинных видов Chrysodeixis, когда традиционные методы морфологической идентификации недостаточны. Молекулярные методы, подобные этому, значительно сокращают время, затрачиваемое на идентификацию каждого образца, позволяют обнаруживать эДНК, значительно увеличивают пропускную способность и повышают вероятность обнаружения. Представленные здесь методы, как правило, могут быть адаптированы к любым недостаточно изученным таксонам чешуекрылых, для которых необходим молекулярный диагностический анализ, и, с корректировкой или тестированием праймеров, могут быть применены к любой группе, для которой разработка профилей рДНК в настольных условиях окажется полезной.

Диагностика видов становится все более важной в глобализированном мире, где перемещение видов (особенно растений и насекомых) под воздействием человека происходит с большей скоростью, чем когда-либо прежде1,2. В условиях увеличения передвижения людей и глобальных поставок сельскохозяйственной продукции, включая продовольственные культуры, срезанные цветы и древесный упаковочный материал, способность быстро обнаруживать и идентифицировать любых связанных с ними насекомых имеет первостепенное значение для ограничения интродукции и укоренения инвазивных видов вредителей3,4. В Соединенных Штатах проверки грузов и товаров в портах въезда и внутренние проверки на наличие экзотических вредителей используются для выявления присутствия насекомых-вредителей. Идентификация этих образцов может быть затруднена и часто зависит от точных данных о хозяине, у которого был обнаружен организм, и о происхождении груза, оба из которых могут быть запутанными из-за перевалки через несколько мест5. Во многих случаях перехваченные вредные организмы могут быть идентифицированы только до семейства, подсемейства или рода. Особенно это касается чешуекрылых, которых перехватывают почти исключительно на личиночной стадии.

Идентификация насекомых, пойманных во время домашних исследований, также является сложной задачей, поскольку перекрестное привлечение к приманкам с феромонами может привести к тому, что в одну ловушку будут пойманы десятки или сотни похожих нецелевых особей. Быстрая идентификация потенциальных целей желательна для обнаружения инвазивных видов до их акклиматизации (т. е. на лаг-фазе6), но для этого часто требуется препарирование каждого образца или молекулярный подход, такой как штрих-кодирование ДНК цитохром-с-оксидазой 1 (CO1)7. Оба подхода отнимают много времени и могут быть ненадежными для видов, которые ранее не были описаны, плохо охарактеризованы или для которых отсутствуют общедоступные данные о последовательностях. Чтобы повысить шансы обнаружения инвазивных видов, были разработаны быстрые или высокопроизводительные молекулярные анализы для некоторых часто перехватываемых и потенциально инвазивных видов насекомых-вредителей (например, 8,9,10,11). Высокопроизводительные методы молекулярной идентификации не только увеличивают вероятность обнаружения, но и значительно сокращают время и затраты, необходимые для завершения идентификации, особенно в случае мультиплексных анализов12,13. Некоторые виды, которые представляют высокий потенциал для инвазии, также недостаточно изучены и им не хватает базовой информации, такой как филогенетическое размещение и описание сестринских видов, филогеографические вариации внутри вида или общедоступные данные о последовательностях7,14.

Хотя для многих видов доступна большая база данных последовательностей CO1 (например, BOLD15, GenBank16), этот регион может плохо подходить для разработки методов, основанных на последовательностях ДНК, таких как ПЦР в реальном времени, из-за высокого содержания АТ, низкой межвидовой изменчивости и /или высокая внутривидовая изменчивость, являющаяся результатом быстрой эволюции и генетического дрейфа17. В таких ситуациях идентификацию вида часто можно надежно провести с использованием участков 45S рибосомальной РНК (рРНК). Среди первых нуклеиновых кислот, которые были секвенированы, 45S рРНК широко распространена в геноме и имеет относительно короткую длину18. Единица рРНК состоит из структурно консервативных тандемных повторов, состоящих из внешнего транскрибируемого спейсера (ETS), 18S рРНК, внутреннего транскрибируемого спейсера (ITS) 1, 5,8S рРНК, ITS2 и 28S рРНК19. Эти свойства рРНК, а также консервативность последовательности в кодирующих областях и высокие темпы эволюции в некодирующих ITS-областях лежащей в основе рибосомальной ДНК (рДНК) привели к использованию этого локуса для филогенетических исследований по всему дереву жизнь20,21. В результате этих филогенетических исследований большое количество данных о последовательностях рДНК стало общедоступным, на основе чего исследователи разработали методы быстрой идентификации видов. Эти локусы идеальны для таких молекулярных анализов, поскольку области ITS относительно консервативны внутри видов, сильно варьируют между видами (как с точечными мутациями, так и с инделами) и присутствуют в геноме в большом количестве копий. Это делает их идеальными кандидатами для разработки ПЦР-анализов на основе зондов8,22,23 и позволяет амплифицировать эти последовательности даже из деградированной ДНК или в сложных образцах окружающей среды24,25. Поскольку последовательности, кодирующие 18S, 28S и 5,8S рРНК, высококонсервативны, разработка универсальных праймеров для амплификации всей этой области возможна, даже если для рассматриваемого вида нет данных о последовательностях рДНК. Однако из-за большого количества копий в одном геноме между копиями внутри человека существуют нуклеотидные различия. Эти внутрииндивидуальные вариации считаются риботипами26,27, и таких риботипических вариаций следует избегать при разработке надежного основанного на ДНК метода идентификации видов, однако характеристика риботипических вариаций редко бывает завершена. Таким образом, использование метода высокопроизводительного секвенирования полезно для характеристики риботипического разнообразия и для дифференциации фиксированных и временных вариаций, существующих между повторами.