Language
Селективное обогащение плазматических клеток
ДомДом > Блог > Селективное обогащение плазматических клеток
ПОСЛЕДНИЕ НОВОСТИ

Селективное обогащение плазматических клеток

Jul 19, 2023

Биология связи, том 6, Номер статьи: 885 (2023) Цитировать эту статью

146 доступов

3 Альтметрика

Подробности о метриках

Было показано, что внеклеточные везикулы (ВВ) являются ключевыми медиаторами внеклеточного транспорта малых РНК. Однако носители бесклеточной информационной РНК (cf-мРНК) в биожидкостях человека и их связь с раком остаются малоизученными. Здесь мы провели транскриптомный анализ фракционированной по размеру плазмы от рака легких, рака печени, множественной миеломы и здоровых доноров. Анализ морфологии и распределения по размерам показал успешное отделение крупных и средних частиц от других фракций растворимых белков плазмы. Мы разработали стратегию очистки и секвенирования сверхнизких количеств cf-мРНК из субпопуляций, обогащенных частицами и белками, с использованием вставок РНК для контроля технической изменчивости и нормализации внутренних резких различий в количестве cf-мРНК, переносимой в каждой популяции. фракция плазмы. Мы обнаружили, что большая часть cf-мРНК была обогащена и защищена в ЭВ с замечательной стабильностью в средах, богатых РНКазами. Мы наблюдали специфические закономерности обогащения ассоциированной с раком cf-мРНК в каждой субпопуляции, обогащенной частицами и белками. Дифференцирующие гены, обогащенные EV, были связаны с конкретными биологическими путями, такими как иммунная система, функция печени и регуляция токсичных веществ при раке легких, раке печени и множественной миеломе соответственно. Наши результаты показывают, что анализ сложности субпопуляций ЭВ проливает свет на их биологическое значение и предлагает многообещающий подход к жидкой биопсии.

Бесклеточная РНК (cfRNA), также известная как внеклеточная РНК (exRNA), присутствует во многих жидкостях организма, включая спинномозговую жидкость (CSF), слюну, сыворотку, мочу и плазму1,2,3. Наиболее часто встречающимися биотипами вкРНК являются малые некодирующие РНК (нкРНК), которые включают микроРНК (миРНК), фрагменты транспортной РНК (тРНК) и piwi-взаимодействующие РНК (пиРНК)4. Исследования также обнаружили информационные РНК (мРНК) и длинные некодирующие РНК (днРНК) в биожидкостях5,6,7,8,9. Хотя вкРНК считается более хрупкой и менее распространенной, чем внеклеточная ДНК, из-за высоких уровней РНКазы в крови10, несколько исследований показали, что микроРНК, присутствующие в крови, удивительно стабильны11,12. Многие исследования cfRNA были сосредоточены на характеристике cf-миРНК из-за ее стабильности в жидкостях организма11,12. Однако мы и другие недавно продемонстрировали, что cf-мРНК также могут нести стабильные и специфичные для заболевания сигнатуры, которые можно использовать в качестве неинвазивных биомаркеров8,13,14,15,16,17,18.

cfRNAs связаны с несколькими подклассами носителей, включая внеклеточные везикулы (EV), рибонуклеопротеины, а также липопротеины, такие как: хиломикроны, липопротеины очень низкой плотности (VLDL), липопротеины низкой плотности (LDL) и липопротеины высокой плотности (HDL). Типы и пропорции грузов РНК, упакованных в разные носители, могут зависеть от типа биожидкости, преаналитических факторов, а также физиологических или патологических состояний. Консорциум связи внеклеточных РНК (exRNA) NIH создал ресурс атласа exRNA, в котором тщательно сравнивались основные носители микроРНК посредством вычислительной деконволюции в 19 исследованиях2,19. Эти сравнительные статистические исследования выявили пять типов грузов микроРНК, которые связаны с известными везикулярными и невезикулярными носителями2. В то время как эти исследования показали, что ЭВ являются ключевым медиатором транспорта РНК, другие показали, что РНК-связывающие белковые комплексы могут переносить микроРНК независимо от везикул в плазме человека12,13,20. Идентификация носителей cf-мРНК, которые обеспечивают стабильность в богатой РНКазой плазме, может выявить основные биологические и функции, а также потенциальную отдельную форму биомаркеров, специфичных для носителей, для клинического применения. Было показано, что в кондиционированных средах для культивирования клеток cf-мРНК связана с ЭВ13,20. Однако вопрос о том, какие носители связываются с cf-мРНК в биожидкости человека, остается плохо изученным1,21.

 0.05; *P < 0.05, **P < 0.01, and ****P < 0.0001) with three technical replicates of FR14 and FR58 of plasma pooled from three healthy individuals. c A box plot of negative raw cycle threshold (- raw ct) of individual genes with RNase and/or detergent treatment using qRT-PCR. RNA isolated from combined FR14 and FR58 using three healthy individuals and three technical replicates of control RNA were treated with RNase and/or detergent. Data are analyzed using RStudio and reported as means ± SD of three independent samples./p> 1) between each cancer type and healthy controls within a specific fraction (Fig. 5a). We used permutation tests to evaluate the statistical significance of DE analysis (Supplementary Fig. 9). To analyze the enrichment patterns, we calculated fold change of these DE genes identified between each cancer type compared with controls within each fraction and visualized in a heatmap (Fig. 5a). We found that, compared to healthy controls, the fractionated plasma of lung cancer patients had significantly upregulated mRNAs, specifically 136, 199, 462, 151, 105, and 7 within medium EVs, small EVs, non-EV particles, early-, middle-, and late-eluting protein fractions respectively (Supplementary Fig. 10a). Intriguingly, the heatmap visualization of fold changes in cancer patients compared with healthy controls displayed distinct enrichment patterns of lung cancer-differentiating cf-mRNA, specific to EV and protein subpopulations (Fig. 5b). The majority of DE genes are enriched in specific EV and protein fractions with very few DE mRNA being shared between fractions (Supplementary Fig. 10). To assess the potential roles of these selectively enriched cancer distinguishing gene sets in each plasma fraction, we performed pathway enrichment analysis using g:Profiler curated on gene ontology and Reactome databases, Cytoscape, and EnrichmentMap (Fig. 5a). Differentiating genes enriched in FR14 (medium EVs) from lung cancer were associated with both immune system and metabolic process (Fig. 5c), while DE genes enriched in FR912 (non-EV particles fraction) were implicated in the immune system and myeloid leukocyte mediated response (Fig. 5c). Differentiating genes enriched in FR1619 (early-eluting protein) from lung cancer were enriched in protein localization nucleus, steroid hormone corticosteroid, and defense virus symbiont, while DE genes enriched in FR3033 (late-eluting protein) were enriched in sphingolipid metabolism (Fig. 5c)./p> 1). After DE genes were identified, log2 fold change (log2FC) was calculated by subtracting log2 counts of cancer from individual biological replicates to the mean of corresponding healthy fractions. Gene lists were organized by fraction. DE genes were identified for selective packaging heatmap analysis. Using the DE genes identified from each fraction, g:Profiler was performed on gene ontology biological properties and reactome for functional enrichment analysis. Pathway enrichment analysis was performed using Cytoscape and EnrichmentMap. b Heatmap of gene expression in lung cancer relative to healthy across fractions. c Enrichment map for lung cancer DE genes found in individual fractions using Gene Ontology (Biological properties) and Reactome with FR14, FR912, FR1619, and FR3033 color coded by red, green, purple and yellow, respectively. Cluster represents (i) steroid hormone corticosteroid, (ii) Cellular response chemical, (iii) defense virus symbiont, (iv) regulation myeloid cell, (v) negative regulation response, (vi) toll cell receptor 4, (vii) g1 specific transcription, and (viii) hemidesmosome assembly. Cluster of nodes were automatically labeled using the AutoAnnotate from Cytoscape./p> 1) per cancer type compared to healthy controls within each fraction. Intriguingly, our heatmap visualization of enrichment patterns revealed distinct multiple cancer differentiating cf-mRNA specific to EV and protein fractions (Fig. 6a). Although there is a slight increase in expression of cf-mRNA between small EV-associated lung cancer DE genes with multiple myeloma and liver cancer, the majority of these genes were not differentially expressed within multiple myeloma and liver cancer. In addition, we performed functional enrichment analyses on these combined gene sets and found the majority of biological function related terms were unique for each cancer type and fraction with minimal overlap on humoral response antimicrobial from both FR14 of lung cancer and FR2326 of multiple myeloma (Fig. 6b). These overall selective enrichment patterns associated with multiple cancers within EV subpopulations and protein fractions suggests that distinct cf-mRNA are packaged into different types of extracellular carriers in cancer./p> 1. To test the significance of the differential expression results for each pairwise comparison of cancer to healthy control per fraction, we performed a permutation test in which differential expression analysis between two groups of randomized samples was compared using the DESeq2 package. For each pair, 1000 permutations of random shuffling were performed and the number of differentiating genes with padj < 0.05 were documented for building a histogram, and compared to the number of significant genes (padj < 0.05) for the group with correct labeling./p> 1 from DESeq2 (v1.22.2). For DegPattern analysis from R package DEGreport (v1.18.1), a total of 11,577 differentially expressed genes determined by one-way ANOVA test across plasma fractions with false discovery rate less than 0.05 were used./p>