Полнотолщина 3D-модели конъюнктивы in vitro позволяет дифференцировать бокаловидные клетки

Научные отчеты, том 13, Номер статьи: 12261 (2023) Цитировать эту статью

204 доступа

Подробности о метриках

Культивирование in vitro и получение высокоспециализированных бокаловидных клеток по-прежнему остается серьезной проблемой при разработке конъюнктивальных 3D-эквивалентов in vitro. Модель, включающая все физиологические факторы, включая бокаловидные клетки, секретирующие слизь, может стать новой платформой для исследований заболеваний конъюнктивы. Мы выделили первичные эпителиальные клетки конъюнктивы и фибробласты из биопсий человека. 3D-модели были созданы либо из эпителиальных слоев, либо из их комбинации с эквивалентом соединительной ткани. Эпителиальные модели исследовали на предмет экспрессии маркеров и барьерной функции. Модели полной толщины были проанализированы на предмет морфологии бокаловидных клеток и экспрессии маркеров с помощью иммунофлуоресценции и количественной ПЦР в реальном времени. Простые модели эпителия, культивированные на границе раздела воздух-жидкость, показали многослойный многослойный эпителий с патологическим ороговением и без образования бокаловидных клеток. Комбинация с эквивалентом соединительной ткани для создания модели полной толщины привела к образованию неороговевающего многослойного многослойного эпителия и индуцировала дифференцировку бокаловидных клеток. В нашей модели высокое сходство с естественной конъюнктивой было достигнуто за счет сочетания эпителиальных клеток конъюнктивы с фибробластами, заключенными в коллаген-гидрогель как эквивалент соединительной ткани. В будущем наш конъюнктивальный эквивалент in vitro позволит исследовать дифференцировку бокаловидных клеток, патологии конъюнктивы, а также тестировать лекарства.

Конъюнктива способствует образованию слезной пленки на поверхности глаза, выделяя разглаживающую слизь1,2. Важнейшими функциями конъюнктивы являются защита от механических и патогенных воздействий, а также способность реагировать на вредные вещества и аллергены посредством IgE- и эозинофил-регулируемой продукции слизи3. Посредством этого механизма конъюнктива вносит свой вклад в привилегированную иммунную систему поверхности глаза. Неблагоприятные воздействия, такие как колебания влажности, сухость глаз, аллергены, инфекции и аутоиммунные реакции, например, синдром Стивенса-Джонсона или пемфигоид слизистой оболочки, могут вызвать разрушение конъюнктивы и, в конечном итоге, слепоту4,5.

В неороговевающем эпителии от 2 до 9 слоев многослойных плоских и столбчатых клеток вкраплены высокоспециализированные бокаловидные клетки. Их секретируемые муцины способствуют формированию слезной пленки, обеспечивая гладкую поверхность глаза. Высокий процент внутренней части бокаловидных клеток заполнен везикулами, содержащими слизь, тогда как ядра клеток располагаются на их базальной стороне6. В целом муцины тканезависимы и делятся на два класса: мембраносвязанные и секретируемые муцины. В контексте конъюнктивального эпителия были идентифицированы мембраносвязанные муцины MUC1, MUC4 и MUC16, а также секретируемый гелеобразующий муцин MUC5AC и секретируемый растворимый MUC71,7. Бокаловидные клетки конъюнктивы в основном экспрессируют MUC5AC и в меньшей степени MUC161,8,9. В последние годы были разработаны тест-системы конъюнктивы in vitro с использованием 2D и 3D культуры для выявления конъюнктивита, сухости глаз, миграции фибробластов птеригиума, фиброза, а также доставки лекарств и предоставили важную информацию10,11,12,13. Разными авторами были разработаны сложные 3D-модели, охватывающие всю структуру конъюнктивы, в которых в качестве каркаса для культуры эпителиальных клеток сверху использовался эквивалент соединительной ткани. В этих исследованиях использовались каркасы из коллагена I, фибрина или децеллюляризированной конъюнктивы, тогда как матрицы коллагена I и фибрина включали стромальные клетки14,15,16. Эти модели смогли ответить на конкретные вопросы исследований конъюнктивы, включая дифференцировку, исследования воспаления и клинические цели. Хотя слизь можно обнаружить в этих моделях с помощью ELISA и окрашивания Alcianblue/PAS, культуры эксплантов трудно стандартизировать, а модели конъюнктивы, созданные in vitro, демонстрируют некоторые, но не все характеристики. Следовательно, все еще существует потребность в модели, которая сочетает в себе многослойный многослойный эпителий с бокаловидными клетками и специфическим окрашиванием MUC5AC внутри их чашеобразных структур. Более того, культивирование этих специализированных бокаловидных клеток остается серьезной проблемой из-за отсутствия или неизвестности ключевых факторов их развития6.