Скрининг не

Nature Communications, том 14, номер статьи: 5294 (2023) Цитировать эту статью

Подробности о метриках

Saccharomyces cerevisiae — это «рабочая лошадка» промышленной биотехнологии благодаря известности этого организма в спиртовой ферментации и набору сложных генетических инструментов, доступных для управления его метаболизмом. Однако S. cerevisiae не подходит для перепроизводства многих массовых биопродуктов, поскольку токсичность ограничивает производство высоких титров. Здесь мы используем высокопроизводительный анализ для проверки 108 общедоступных штаммов дрожжей на толерантность к 20 г л-1 адипиновой кислоты (АК), предшественника нейлона. Мы идентифицировали 15 толерантных дрожжей и отобрали Pichia occidentalis для производства цис, цис-муконовой кислоты (СКК), предшественника АК. Разработав набор инструментов для редактирования генома P. occidentalis, мы демонстрируем периодическое производство CCM с максимальным титром (38,8 г л-1), выходом (0,134 г г-1 глюкозы) и продуктивностью (0,511 г л-1 ч-1). ), что превосходит все показатели, достигнутые с использованием S. cerevisiae. Эта работа приближает нас к промышленному биопроизводству АК и подчеркивает важность выбора хозяина в биопереработке.

Исторически пивные дрожжи (Saccharomyces cerevisiae) были предпочтительным микробным хозяином для перепроизводства топлива, химикатов и фармацевтических препаратов. Однако из-за низкой стоимости многих сыпучих химикатов и биотоплива концентрации, необходимые для производства в коммерческих масштабах, часто токсичны для S. cerevisiae и других модельных организмов. Например, S. cerevisiae не способен поддерживать рост при низких и умеренных концентрациях бутанола (2%)1, ванилина (0,05%)2, бензальдегида (0,1–0,2%)3 и многих органических кислот (0,25–2,5%). 4,5,6. Органические кислоты представляют собой особую проблему биопереработки, поскольку идеальный биопроцесс органических кислот должен осуществляться при кислом pH, что упрощает последующее восстановление недиссоциированной формы и позволяет избежать необходимости поддержания pH во время ферментации. Однако токсичность кислоты обратно пропорциональна pH, поскольку недиссоциированные кислоты (pH < pKa) свободно диффундируют в клетки и диссоциируют в цитозоле (pH 5–7)7. Соответственно, чтобы избежать токсичности продукта, культивирование большинства штаммов S. cerevisiae и других микробов, продуцирующих органические кислоты, проводится при pH > pKa8,9,10.

Адипиновая кислота представляет собой дикарбоновую кислоту C6, используемую при производстве нейлона 6,6. При годовом объеме производства в три миллиона тонн и мировом рынке в шесть миллиардов долларов США11 Министерство энергетики США классифицирует адипиновую кислоту как «супертовар»12. Глобальный спрос на адипиновую кислоту в настоящее время удовлетворяется с помощью химического процесса с участием циклогексана и азотной кислоты, но этот метод использует нефтехимические ресурсы и высвобождает закись азота, мощный парниковый газ, что побуждает к исследованию более устойчивых путей ее производства. Естественных путей биосинтеза адипиновой кислоты не существует, но предложено по крайней мере восемь инженерных биохимических путей ее биопроизводства11. Из этих путей наибольший прогресс был достигнут при использовании пути цис,цис-муконовой кислоты (CCM). В этой стратегии используются три гетерологичных фермента: 3-дегидрошикиматдегидратаза, декарбоксилаза протокатехиновой кислоты и катехолдиоксигеназа, для синтеза CCM из 3-дегидрошикимата, промежуточного продукта шикиматного пути. CCM превращается в адипиновую кислоту путем гидрирования ферментами еноат-редуктазой, однако бактериальные варианты, охарактеризованные на сегодняшний день, плохо функционируют в дрожжах-хозяевах13, достигая молярного превращения CCM в адипиновую кислоту <0,9%14. В отсутствие подходящей еноатредуктазы, активной для дрожжей, S. cerevisiae был сконструирован для синтеза CCM с титром, выходом и продуктивностью до 22,5 г л-1, 0,1 г г-1 глюкозы и 0,21 г л-1. h−1 соответственно9,10. Несмотря на эти достижения, процессы дрожжевого СКК выполняются при pH 5–6, что значительно выше рКа СКК (3,87) и сохраняет кислоту в диссоциированной форме, чтобы ограничить токсичность продукта.

В ответ на плохую толерантность S. cerevisiae ко многим массовым биопродуктам фокус сместился на скрининг нетрадиционных видов дрожжей на наличие фенотипов, лучше подходящих для промышленного применения15. Выбор штамма является критически важным и часто упускаемым из виду аспектом разработки биопроцессов, поскольку выбор микробного хозяина, адаптированного к целевому конечному продукту, вероятно, позволит сократить вмешательство в инженерию штамма, упростить последующее разделение, ограничить токсичность продукта и улучшить общие показатели процесса16. Например, Yarrowia lipolytica — маслянистый и осмотолерантный хозяин, который хорошо подходит для производства жирных кислот и алканов17, Kluyveromyces marxianus — быстрорастущие термотолерантные дрожжи18, а Pichia kudriavzevii — устойчивый кислотоустойчивый хозяин, используемый для производства разнообразных органические кислоты19. Приблизительно 1500 видов дрожжей были классифицированы по более чем 100 родам, а общедоступные хранилища культур содержат тысячи различных штаммов дрожжей. Большинство этих видов дрожжей можно культивировать в лаборатории на стандартных средах20, а крупные достижения в области секвенирования генома, системной биологии и инженерии штаммов резко сократили затраты и трудозатраты, необходимые для генетического одомашнивания нетрадиционных хозяев. Сложные генетические инструменты были разработаны для различных видов дрожжей, включая Y. lipolytica21, K. marxianus18 и P. Pastoris22, что открывает новые возможности для выбора хозяина помимо Saccharomyces.