Генотипированный функциональный скрининг растворимых Fab-клонов позволяет

Том 13 научных отчетов, номер статьи: 13107 (2023) Цитировать эту статью

303 доступа

1 Альтметрика

Подробности о метриках

Моноклональные антитела (мАт) и их фрагменты широко используются в терапии, диагностике и фундаментальных исследованиях. Хотя методы отображения, такие как фаговый дисплей, обеспечивают высокую производительность, необходимо точно измерять сродство отдельных антител в растворимом формате. Мы разработали платформу скрининга, способную предоставлять генотипированные функциональные данные из в общей сложности 9216 клонов растворимых индивидуальных антигенсвязывающих фрагментов (Fab) с помощью секвенирования нового поколения (NGS) с иерархической индексацией. Полноразмерные парные последовательности вариабельного домена (VL-VH) связаны с данными функционального скрининга, что позволяет проводить углубленный анализ эффектов мутаций. Платформу применяли в четырех проектах скрининга scFv/Fab, выбранных с помощью фагового дисплея, и в одном проекте по созреванию аффинности VH с насыщением сайта. Генотипированный функциональный скрининг одновременно позволил идентифицировать мутации, улучшающие аффинность, в домене VH Fab 49A3, распознающие неструктурный белок 1 (NS1) вируса Денге серотипа 2, и информировать о положениях остатков VH, которые нельзя изменить по сравнению с диким типом без снижения аффинности. Идентификация на основе генотипа показала нам степень внутриклональной дисперсии сигнала, присущую данным одноточечного скрининга, - явление, которое часто упускают из виду в полевых условиях. Более того, генотипированный скрининг устранил избыточный отбор идентичных генотипов для дальнейшего изучения и предоставил новый инструмент анализа для оценки успеха выбора фагового дисплея и оставшегося клонального разнообразия в проверенных репертуарах.

Разработка рекомбинантных антител — это история успеха в области биотехнологии. Моноклональные антитела (мАт) и их фрагменты, такие как одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv) и антигенсвязывающий фрагмент (Fab), широко используются в терапии, диагностике и в качестве инструментов фундаментальных исследований1. По мере открытия новых целевых молекул для этих применений необходимы новые или улучшенные связующие с высоким сродством, специфичностью и желаемыми физико-химическими свойствами.

Меньший размер фрагментов антител и отсутствие Fc-домена дают несколько преимуществ по сравнению с полноразмерными IgG, включая лучшее проникновение в ткани2,3 и меньшую вероятность вмешательства в диагностические анализы in vitro4. С точки зрения инженерии антител, основным преимуществом простой структуры фрагментов антител является их экономичная и легкая экспрессия в E. coli, что позволяет использовать их для фагового дисплея5. Передовые технологии библиотеки генов рекомбинантных антител6,7 в сочетании с высокопроизводительными методами отображения предлагают эффективный способ обогащения связывающих веществ против широкого спектра мишеней8.

Хотя методы отображения имеют высокую производительность, аффинность и специфичность отдельных связывающих веществ необходимо оценивать путем скрининга большого количества отдельных антител в растворимом формате. В некоторых исследованиях сообщалось о потере специфичности после того, как фаг-экспонированные фрагменты антител были преобразованы в растворимый формат9,10. Это можно объяснить изменением конформации scFv после потери поддержки со стороны белка pIII, который является наиболее распространенным партнером scFv по слиянию для дисплея10. Также имеются сообщения о потере аффинности после прямого преобразования формата scFv в формат IgG11,12, что значительно ограничивает области применения обнаруженных антител. Более того, непреднамеренная мультимеризация scFv приводит к более сильному связыванию за счет эффектов авидности, что нежелательно при пэннинге или растворимом скрининге13,14. Однако Fab обычно рассматриваются как мономерные молекулы, что является идеальным форматом скрининга для анализа аффинности, и хотя нельзя исключать существование фаговых частиц с несколькими отображаемыми Fab, риск обогащения из-за эффектов авидности ниже при использовании Fab, чем scFv. фаговые библиотеки13. Помимо надежной оценки аффинности, скрининг растворимых веществ позволяет идентифицировать клоны с хорошим уровнем экспрессии.

3) among the phage display selected libraries. Among genotypes encountered at least three times in the screening campaign, 66.7% did not bind to the SpyCatcher-antigen (S/B < 3), whereas, of the remaining genotypes, 28.9% showed S/B-ratio both above and below the set threefold threshold ratio, and 4.4 % were positive (S/B > 3) in all instances (6.7% if calculated by S/B > 2). On the contrary, anti-DARPin library was over enriched in relation to the number of clones screened, with only 76 unique genotypes, 43% of which were represented between 2 and 331 times with a standard deviation (SD) of 47. Three genotypes, including one used as control, were present with 170 clones or more. The low number of unique clones in the anti-DARPin Fab repertoire is consistent with the selection scheme, as four rounds of Fab-phage selections were carried out with the anti-DARPin library in contrast to three with anti-SpyC library and one to two with anti-NP libraries. The genotype copy numbers per library are shown in Fig. 2b./p> 3) and distribution of functional screening data differed between the phage-derived screening projects. Despite undergoing 4 + 4 rounds of phage display, it appears that the anti-SpyCatcher library was not fully enriched and could have potentially benefited from an additional round of phage display selection or a reconsideration of the selection strategy. The selection campaign involved various antigens, including chemically biotinylated SpyCatcher, scFv-SpyCatcher, and in vivo biotinylated Spy- and SdyCatcher proteins, aiming to enhance binding towards the catcher rather than the SA-biotin linker. The insufficient enrichment is evidenced by the low number of identical genotypes in the screened set and a relatively low hit rate of 13%. Low hit rate can also be seen in the distribution of the functional signal data (Fig. 2), which is heavily bottom weighted. In the remaining three projects, the hit rates were higher and also the shared genotypes more abundant. In the case of the anti-DARPin library the selection could have been screened after the 3rd round instead of the 4th round of panning, as only a few genotypes were represented in the data, which also had a quite evenly distributed functional signal. NP-1 and NP-2 both come from the same Fab-converted phage library origin, but the functional data between them is very different, with NP-2 having more evenly distributed signals between clones. This was expected, as the last two selection rounds and assay formats were different. NP-2 Fabs were first bound on the wells, followed by addition of biotinylated antigen and detected with Eu-labeled streptavidin, whereas NP-1 Fabs were selected to bind antigen captured by the control Fab N1G1, and the presence of E. coli-expressed Fab-APs was detected with europium-labeled anti-alkaline phosphatase antibody./p>