Создание биобанка Plasmodium vivax для функциональных анализов ex vivo.

Журнал «Малярия», том 22, номер статьи: 250 (2023 г.) Цитировать эту статью

Подробности о метриках

Plasmodium vivax является второй по распространенности причиной малярии, однако ее изучение остается сложным из-за отсутствия системы непрерывного культивирования in vitro, что подчеркивает необходимость создания биобанка клинических изолятов с несколькими замораживаниями каждого образца для использования в функциональных анализах. Были сравнены различные методы криоконсервирования изолятов паразитов и впоследствии валидирован наиболее перспективный из них. Обогащение паразитов на ранних и поздних стадиях, а также созревание паразитов были количественно оценены для облегчения планирования анализа.

Для сравнения протоколов криоконсервации девять клинических изолятов P. vivax были заморожены с четырьмя смесями на основе глицеролита. Восстановление паразитов после оттаивания, после обогащения KCl-Percoll и в краткосрочной культуре in vitro измеряли с помощью предметной микроскопии. Было измерено обогащение паразитов на поздних стадиях с помощью магнитно-активированной сортировки клеток (MACS). Также сравнивали краткосрочное и долгосрочное хранение паразитов при температуре – 80 °C или жидком азоте.

Из четырех смесей криоконсервации одна смесь (глицеролит:сыворотка:эритроциты в соотношении 2,5:1,5:1) приводила к улучшению восстановления паразитов и статистически значимому (P <0,05) увеличению выживаемости паразитов в краткосрочной культуре in vitro. Впоследствии с использованием этого протокола был создан биобанк паразитов, в результате чего была собрана коллекция из 106 клинических изолятов, каждый из которых содержал 8 флаконов. Качество биобанка было подтверждено путем измерения нескольких факторов из 47 оттепелей: среднего снижения паразитемии после оттаивания (25,3%); среднее кратное обогащение после KCl-Percoll (6,65-кратное); и средний процент выздоровления паразитов (22,0%, измеренный по 30 изолятам). При кратковременном культивировании in vitro у 60,0% изолятов к 48 ч наблюдалось устойчивое созревание паразитов кольцевой стадии до более поздних стадий (>20% трофозоитов, шизонтов и гаметоцитов). Обогащение зрелых стадий паразита с помощью MACS показало хорошую воспроизводимость: в среднем 30,0% паразитемии после MACS и в среднем 5,30 × 105 паразитов/флакон. Наконец, было проверено влияние температуры хранения, и не наблюдалось значительного влияния краткосрочного (7 дней) или длительного (7–10 лет) хранения при -80 °C на восстановление, обогащение или жизнеспособность паразитов.

Здесь оптимизированный метод замораживания клинических изолятов P. vivax демонстрируется как шаблон для создания и проверки биобанка паразитов для использования в функциональных анализах.

Plasmodium vivax является наиболее географически распространенным видом малярийных паразитов и является вторым по величине бременем малярии в мире. Хотя общая заболеваемость P. vivax во всем мире снизилась с 20,5 миллионов случаев в 2000 г. противомалярийные препараты.

Исследования фундаментальной биологии P. vivax были сильно ограничены из-за отсутствия системы непрерывного культивирования in vitro [2,3,4]. Отсутствие непрерывного культивирования приводит к необходимости использования клинических изолятов P. vivax для экспериментальных исследований, а ограниченный доступ к этим изолятам препятствует прогрессу в расширении знаний об этом паразите. Недавно были разработаны краткосрочные подходы к культивированию P. vivax in vitro (включая в некоторых случаях использование криоконсервированных изолятов) [3, 5, 6], что позволяет проводить одноцикловые исследования лекарственной устойчивости [3, 7]. а также анализы инвазии для оценки тропизма ретикулоцитов хозяина [8], эффектов ингибирующих инвазию антител [9,10,11,12,13,14,15,16] и мутантов рецепторов хозяина [17, 18]. Растет признание важности биобанков образцов инфекционных заболеваний [19,20,21], включая Plasmodium falciparum [22,23,24]. Создание биобанка криоконсервированных изолятов P. vivax, которые можно будет надежно разморозить для дальнейших экспериментов (функциональные анализы, анализы экспрессии генов, геномика), станет критически важным ресурсом для дальнейшего развития в этой области [4].

0.01% were included for further analysis. The blood was centrifuged at 800g for 5 min at room temperature, and serum from each isolate was separated and stored at − 80 °C for related studies. The pelleted blood was washed using phosphate buffered saline (Thermo Fisher Scientific, USA, #J61196.AP) supplemented with 0.5% (w/v) bovine serum albumin (Millipore Sigma USA, #10735086001) to separate any leftover serum components. Prior to cryopreservation, the pelleted blood was separated from leukocytes, by running the sample through CF-11 column filters prepared in the lab. Smears were prepared post processing with CF-11 to assess parasite stages and to examine the leukocyte removal. De-leukocyted samples were cryopreserved using Glycerolyte 57 (Baxter/Fenwal USA, #4A7833), added as follows: glycerolyte 57:serum:RBC ratio was 2:0:1 for mixture 1 [7], 2.5:1.5:1 for mixture 2 [35, 39], 1.66:0:1 for mixture 3 [36] and 4.15:1.5:1 for mixture 4. Samples were stored in cryovials (Fisher Scientific USA, #50001020) at − 80 °C for 24 h prior to long-term storage in liquid nitrogen cryo-tanks at − 196 °C. The serum used in the study was heat-inactivated AB + pooled plasma (Access Biologicals, USA, #A17054) collected from a non-malaria endemic region./p> 80% are infected with P. vivax [42]. The ability to collect this number of P. vivax isolates has made GMC a unique setting to develop a biobank of cryopreserved parasites for future experimentation. From 2012 to 2016, over 700 P. vivax isolates were cryopreserved using the method from Kosaisavee et al. [7], where a 2:1 ratio of the cryoprotectant glycerolyte:RBCs was used. Other ratios of glycerolyte:RBCs have been reported in the literature for cryopreservation of both P. falciparum and P. vivax (Additional file 1: Table S1). Four cryopreservation mixtures, derived from established cryopreservation protocols [7, 34, 36, 39], (Fig. 1A) that varied in the ratios of glycerolyte:RBCs (with or without the addition of serum) were tested in order to identify any differences from the established 2:1 glycerolyte:RBC ratio./p> 50%) of either immature parasites (early and late rings) or maturing parasites (trophozoites, schizonts and gametocytes) (Fig. 3B). Post enrichment, all isolates had at least 20% immature parasites. At 24 h, 57.9% (11/19) had > 20% mature stages, and a subset of 26.3% (5/19) had > 50% mature stages. These proportions did not change appreciably as by 48 h, 60% of isolates (12/20) had > 20% mature stages with 30% (6/20) having > 50% mature stages./p> 0.2% parasitaemia [3]) was demonstrated (Fig. 1C). The measured recovery of parasites using this method is still relatively low (Fig. 1E), suggesting that other improvements to this approach may be possible. Future experiments should also directly measure the recovery of reticulocytes (both uninfected and infected) as well as the effectiveness of recovery and maturation of sexual stages [49], which may be useful for future transmission studies./p>